由于熒光顯微鏡的低分辨率和靈敏度以及缺乏觀察病原體的超微結(jié)構(gòu)信息，宿主細(xì)胞內(nèi)的胞內(nèi)病原體的成像變得復(fù)雜。在此，作者提出了一種新的方法來(lái)觀察這些病原體在感染過(guò)程中的情況，從而避免了這些問(wèn)題：通過(guò)對(duì)胞內(nèi)病原體鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行生物正交標(biāo)記褂圣，并通過(guò)使用這些生物正交組來(lái)引入與隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡STORM兼容的熒光團(tuán)筷频，并將其置于相關(guān)的光電子顯微鏡（CLEM）工作流程中雾棺，病原體可以在其宿主細(xì)胞環(huán)境鼠傷寒菌中成像斗躏，分辨率為20 nm逝慧。因此，STORM-CLEM方法提供了一種了解這些病原體感染過(guò)程的新方法父森。

研究介紹（節(jié)選）

抗生素耐藥性的上升是全球健康的主要威脅之一保跨。在這方面，一類病原體被證明是特別麻煩的秽烫，這類病原體是細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌强媚。它們通過(guò)在宿主細(xì)胞吞噬體中駐留和復(fù)制而阻礙免疫檢測(cè)。通過(guò)分泌操縱吞噬體成熟的因子耙窥，它們確保了它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的存活捞幅，盡管哺乳動(dòng)物宿主部署了大量的防御機(jī)制，因此还皮，在細(xì)胞和分子水平上理解細(xì)菌-宿主相互作用是極其重要的闲窃。生物正交化學(xué)已被證明是研究這些宿主-病原體相互作用的一項(xiàng)重大突破性技術(shù)。然而效岂，目前我們?cè)囉玫臉?biāo)記方法要么需要將對(duì)生物正交甲硫氨酸骇诈、苯丙氨酸或正亮氨酸類似物具有特異性的突變tRNA/tRNA合成酶對(duì)引入病原體以實(shí)現(xiàn)所需基團(tuán)的摻入，要么具有低靈敏度额前。這就限制了它們僅用于那些技術(shù)可用于的細(xì)菌菌株浊洞。

在過(guò)去的幾年里，超分辨率成像技術(shù)蓬勃發(fā)展胡岔，實(shí)現(xiàn)了納米級(jí)的分辨率 法希。 作者在之前研究的基礎(chǔ)上，加入了超分辨率顯微鏡 靶瘸，這將有助于克服與病原體相關(guān)的障礙：隨機(jī)光學(xué)分辨率顯微鏡STORM 在實(shí)驗(yàn)中靈敏度和改進(jìn)的分辨率苫亦，使熒光信號(hào)的分辨率與TEM更接近，并提高檢測(cè)靈敏度怨咪，允許通過(guò)CLE M對(duì)遺傳未修飾的病原菌進(jìn)行成像著觉。

研究結(jié)果（節(jié)選）

使用STORM-CLEM進(jìn)行生命周期研究的一種病原體是鼠傷寒沙門氏菌（以下簡(jiǎn)稱沙門氏菌）。鼠傷寒桿菌或沙門氏菌）惊暴。這是一種革蘭氏陰性兼性胞內(nèi)病原體饼丘，通過(guò)攝取后分泌各種效應(yīng)蛋白來(lái)確保其在胞內(nèi)存活。它們調(diào)節(jié)細(xì)菌所駐留的吞噬體的成熟辽话，以產(chǎn)生適合其生存和復(fù)制的寄生泡肄鸽。為了將我們的STORM-CLEM應(yīng)用于沙門氏菌的成像，我們首先評(píng)估了我們是否可以通過(guò)使用BONCAT將生物正交氨基酸類似物摻入到足夠的水平油啤，以允許在被吞噬細(xì)胞攝取后對(duì)細(xì)菌蛋白質(zhì)組進(jìn)行ccHc檢測(cè)啄灭，而不影響細(xì)菌的生長(zhǎng)和感染性膏娃。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)分析Hp-S.鼠傷寒標(biāo)記及標(biāo)記在體外和細(xì)胞內(nèi)的持久性。

鼠傷寒與Met（4 mm）或Hpg（0.04-4 mm）一起孵育囊喜，然后進(jìn)行固定并用Alexa-647-疊氮化物進(jìn)行ccHc蚜再。(B)通過(guò)孵育用0.4mmHpg孵育鼠傷寒沙門氏菌30分鐘，并在指定時(shí)間測(cè)量ccHc信號(hào)汪具。(C)顯示DsRed表達(dá)作為細(xì)菌總數(shù)的測(cè)量值(D)顯示ccHc信號(hào)在0-3 h內(nèi)持續(xù)存在率敞。

我們接下來(lái)使用STORM-CLEM方法檢測(cè)BM-DC內(nèi)的Hpg-沙門氏菌（圖2）。

圖2 用Hpg-S處理的BM-DC 75 nm冷凍切片的超分辨率N-STORM-CLEM圖像滞逼。

鼠傷寒將BM-DC與Hpg-S孵育灯狠。用磷酸鹽緩沖液洗滌以除去未結(jié)合/未內(nèi)化的S.鼠傷寒將細(xì)胞固定并進(jìn)行Tokuya樣品制備，并冷凍切片成75 nm切片泄肆。在ccHc條件下（紅色）黔晶，用Alexa-647-疊氮化物處理切片。左圖：Hpg-S超分辨率N-STORM成像的示例A）1和B）2鹤协。鼠傷寒右圖：左側(cè)面板的超分辨率CLEM圖像椎沟。箭頭表示吞噬體外信號(hào)。比例尺：250 nm味滞。

結(jié)果表明樱蛤，熒光標(biāo)記Hpg-S的準(zhǔn)確性和檢測(cè)靈敏度均優(yōu)于對(duì)照組。STORM圖像的鼠傷寒 沙門氏菌感染率明顯高于低分辨率共聚焦圖像桃犬。隨后通過(guò)電子顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)環(huán)境顯示STORM沒(méi)有破壞吞噬細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)刹悴。發(fā)現(xiàn)膜是完整的行楞，并且相對(duì)于那些沒(méi)有通過(guò)STORM分析的區(qū)域攒暇，在經(jīng)過(guò)STORM成像的樣品區(qū)域之間沒(méi)有觀察到結(jié)構(gòu)變化。細(xì)胞器根據(jù)其獨(dú)特的形態(tài)學(xué)外觀很容易識(shí)別子房。STORM圖像的相關(guān)性表明生物正交信號(hào)主要在沙門氏菌或寄生液泡周圍直徑約為10-20 nm的小結(jié)構(gòu)上形用。

這是第一個(gè)使用生物正交組的超分辨率隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡（STORM）-相關(guān)光電子顯微鏡（CLEM）及其在宿主-病原體相互作用研究中的應(yīng)用的例子，因此可以用來(lái)在空間上詳細(xì)的宿主環(huán)境中觀察非轉(zhuǎn)基因病原體证杭。與作者的方法和以前報(bào)道的方法相比田度，STORM的靈敏度甚至允許檢測(cè)細(xì)胞外蛋白產(chǎn)物。這開(kāi)啟了成像病原體的可能性解愤，對(duì)于這些病原體镇饺，先前的生物正交非規(guī)范氨基酸標(biāo)記（BONCAT）方法是無(wú)效的。STORMCLEM與BONCAT送讲、tRNA/tRNA合成酶突變體或生物正交細(xì)胞壁標(biāo)記的組合將對(duì)研究這些病原體的體內(nèi)生命周期有價(jià)值戏喊。將這一技術(shù)應(yīng)用于生物正交化學(xué)已經(jīng)發(fā)生變革的其他領(lǐng)域，也將為這些領(lǐng)域增加一個(gè)額外的超微結(jié)構(gòu)維度署咸。

參考文獻(xiàn)References

[1] G. Mitchell, R. R. Isberg, Cell Host Microbe 2017, 22,166–175.

[2] S. Pandey, T. Kawai, S. Akira, Cold Spring Harbor Perspect. Biol. 2015, 7,a016246.

[3] a) M. S. Siegrist, S. Whiteside, J. C. Jewett, A. Aditham,F.Cava, C. R. Ber-tozzi, ACS Chem. Biol. 2013, 8,500–505;b)P.Shieh,M.S.Siegrist, A. J.Cullen, C. R. Bertozzi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2014, 111,5456–5461;c) G. W. Liechti, E. Kuru, E. Hall, A. Kalinda,Y.V.Brun, M. VanNieuwenhze,A. T. Maurelli, Nature 2014, 506,507–510.

[4] a) B. M. Swarts, C. M. Holsclaw, J. C. Jewett, M. Alber,D.M.Fox, M. S.Siegrist, J. A. Leary,R.Kalscheuer,C.R.Bertozzi, J. Am. Chem. Soc. 2012,134,16123–16126; b) K. M. Backus,H.I.Boshoff, C. S. Barry,O.Boutur-eira, M. K. Patel, F. D’Hooge, S. S. Lee, L. E. Via, K. Tahlan, C. E. Barry,B.G.Davis, Nat. Chem.Biol. 2011, 7,228–235;c)F.P.Rodriguez-Rivera, X.Zhou, J. A. Theriot, C. R. Bertozzi, J. Am. Chem. Soc. 2017, 139,3488–3495.

[5] D. C. Dieterich, A. J. Link, J. Graumann, D. A. Tirrell, E. M. Schuman, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 2006, 103,9482–9487.

[6] A. Mahdavi,J.Szychowski, J. T. Ngo, M. J. Sweredoski, R. L. Graham, S.Hess, O. Schneewind,S.K.Mazmanian, D. A. Tirrell, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 2014, 111,433–438.

[7] a) M. Grammel, P. D. Dossa, E. Taylor-Salmon,H.C.Hang, Chem.Commun. 2012, 48,1473–1474;b)M.Grammel, M. M. Zhang, H. C.Hang, Angew.Chem. Int. Ed. 2010, 49,5970–5974; Angew.Chem. 2010,122,6106–6110; c) S. Lin, Z. Zhang, H. Xu, L. Li, S. Chen, J. Li, Z. Hao,P. R. Chen, J. Am. Chem. Soc. 2011, 133,20581–20587.

[8] J. T. Ngo, J. A. Champion, A. Mahdavi, I. C. Tanrikulu, K. E. Beatty, R. E.Connor,T.H.Yoo,D.C.Dieterich,E.M.Schuman,D.A. Tirrell, Nat.Chem.Biol. 2009, 5,715–717.

[9] A. G. Chande, Z. Siddiqui,M.K.Midha, V. Sirohi, S. Ravichandran, K. V. S.Rao, Sci. Rep. 2015, 5,13430.

[10]R.Hatzenpichler,S.A.Connon,D.Goudeau,R. R. Malmstrom,T.Woyke,V. J. Orphan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2016, 113,E4069–E4078.

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