圖1、由纖維素微纖絲闸与、半纖維素和果膠組成的植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)萄撇，摘自[1]鉴竭。

     與動(dòng)物細(xì)胞不同卑裹，植物細(xì)胞被堅(jiān)固的細(xì)胞壁所包圍悼沈。植物細(xì)胞壁由纖維素嘲叔、半纖維素懦砂、果膠和細(xì)胞壁蛋白質(zhì)構(gòu)成蜒犯，它們的組成和排列方式會(huì)隨細(xì)胞內(nèi)部和外部刺激而動(dòng)態(tài)變化[2]。目前已有多種技術(shù)應(yīng)用于植物細(xì)胞壁成像荞膘，比如原子力顯微鏡罚随、掃描電鏡、傅里葉變換紅外光譜和拉曼顯微鏡等羽资，然而這些技術(shù)都有化學(xué)分辨率或空間分辨率低的缺陷淘菩。

     2020年，Science雜志發(fā)表了巴黎薩克雷大學(xué)Alexis Peaucelle和英國(guó)劍橋大學(xué)Kalina T. Haas等研究人員合作的題為“Pectin homogalacturonan nanofilament expansion drives morphogenesis in plant epidermal cells”的研究論文魏蜒。

     該研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于將傳統(tǒng)的能夠準(zhǔn)確標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)多種大分子的免疫組織化學(xué)染色技術(shù)與多色三維隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)超分辨率顯微鏡（3D-dSTORM）結(jié)合茧音，使對(duì)細(xì)胞壁多糖高靈敏度、高分辨率成像成為可能发凹。STORM超分辨技術(shù)由華人科學(xué)家莊小威發(fā)明盘嘉，其將顯微鏡分辨率推進(jìn)到幾納米冈柑，比光學(xué)衍射極限高近兩個(gè)量級(jí)，極大地促進(jìn)了生物醫(yī)學(xué)研究（圖2）蹲京。

圖2衔密、普通成像與STORM成像效果對(duì)比。微管（綠色）和網(wǎng)格蛋白小窩（紅色）經(jīng)過(guò)免疫熒光標(biāo)記(摘自莊小威實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)站)蚊牌。

     作者指出找蝗，植物細(xì)胞壁是多糖 (例如纖維素，半纖維素和果膠) 的復(fù)雜復(fù)合物诀虹。細(xì)胞壁被認(rèn)為是雙相的: 被半纖維素束縛的結(jié)晶纖維素微纖維被淹沒(méi)在果膠和蛋白質(zhì)的凝膠狀基質(zhì)中渊输。果膠構(gòu)成了結(jié)構(gòu)多樣的多糖家族，具有1,4-連接的 α-半乳糖糖醛酸 (GalpA) 的定義特征记令。作者專門研究了僅包含GalpA線性鏈的高半乳糖醛酸 (HG) 多糖喷聪。高半乳糖苷在含有更復(fù)雜和分支的果膠的雜聚糖 (鼠李糖半乳糖苷I和II型) 以及糖綴合物 (如蛋白聚糖APAP1) 中也以HG聚糖結(jié)構(gòu)域的形式存在。

     作者使用超分辨率三維直接隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡 (3D-dSTORM)和低溫掃描電子顯微鏡 (cryoSEM) 展示了 HG 的同聚糖聚合形式的 muro 納米結(jié)構(gòu)咆瘟。作者發(fā)現(xiàn)，在子葉背斜壁中诽里，HG 組裝成離散的納米絲袒餐，而不是連續(xù)互連的網(wǎng)絡(luò)。作者認(rèn)為它們可能是類似于 X 射線衍射觀察到的四元結(jié)構(gòu)谤狡。由此灸眼，作者制定了路面細(xì)胞形態(tài)發(fā)生的內(nèi)在細(xì)胞壁膨脹“擴(kuò)展梁”模型。在該模型中墓懂，局部同型半乳糖醛酸去甲酯化導(dǎo)致納米絲徑向膨脹焰宣，這是由具有不同包裝的四元結(jié)構(gòu)之間的轉(zhuǎn)換引起的。作者通過(guò)證明單獨(dú) HG 的去甲基酯化足以誘導(dǎo)組織擴(kuò)張來(lái)進(jìn)一步檢驗(yàn)這一假設(shè)捕仔。最后匕积，作者將該模型形式化為預(yù)測(cè)組織拓?fù)洹⒕植考?xì)胞壁厚度榜跌、張力和生長(zhǎng)的三維非線性有限元方法 (FEM) 模型闪唆。

3D-dSTORM納米鏡可深入了解納米級(jí)的生物結(jié)構(gòu)。作者在4微米厚的組織切片上結(jié)合3D-dSTORM和使用針對(duì)高甲基酯化 (LM20) 和低或未酯化 (2F4) HG的抗體進(jìn)行免疫標(biāo)記邪胳，獲得了約40-50納米的橫向和約80納米的軸向分辨率和約800納米的深度重建擅很。兩種抗體在靠近質(zhì)膜的細(xì)胞壁中結(jié)合，但很少在中間薄片中結(jié)合肪尾，這表明抗原表位對(duì)抗體的可及性有限鹅甚，或者在該位置缺乏這種表位(圖3B)。

圖3催蓄、3D-dSTORM納米鏡和cryoSEM揭示了同型alacturonan納米絲夸截。

     3D-dSTORM揭示了在背斜壁中HG形成垂直于子葉表面的排列細(xì)絲邪慧，作者稱之為HG納米絲 (圖3C)。它們的估計(jì)寬度為?40 nm (圖3D)舔躏。相反秆尝，在周壁中，作者沒(méi)有檢測(cè)到絲狀模式防擎，這表明在相同細(xì)胞的不同壁中具有獨(dú)特的HG組織 (圖3E)挎中。作者發(fā)現(xiàn)改變果膠的甲酯化程度會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)，挑戰(zhàn)了此前公認(rèn)的細(xì)胞膨壓驅(qū)動(dòng)細(xì)胞生長(zhǎng)的理論助店。

圖4磁滚、HG甲基化不對(duì)稱性影響葉形成。(A) 在WT宵晚，PME5oe和PMEI3oe子葉中使用3d dstorm成像的代表性葉狀壁段垂攘。橙紫色色圖編碼Z位置。比例尺淤刃，500 nm晒他。

     同時(shí)，作者整理了其中關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法逸贾，并以“Multitarget Immunohistochemistry for Confocal and Super-resolution Imaging of Plant Cell Wall Polysaccharides”為題發(fā)布在Bio-protocol期刊[4]陨仅，以期使更多科研人員能夠?qū)⒚庖呓M化與3D-dSTORM結(jié)合的思路應(yīng)用到自己的研究中。若有需要可按文末文獻(xiàn)名稱搜索铝侵。

參考文獻(xiàn)