慢性腎臟疾病影響著世界上10%以上的人口身诺，其中大多數(shù)源于腎小球的損傷确确。腎小球過濾屏障（GFB）是一種能夠在血流和尿液之間選擇性滲透的復雜結(jié)構(gòu)。 作為GFB組成部分之一的腎小球基底膜（GBM）瞄沙，是腎小球超濾的重要介質(zhì)啰蹲，它由內(nèi)皮細胞和其兩側(cè)足細胞分泌的細胞外基質(zhì)（ECM）蛋白組成初茶。 一旦GFB中的任何組成部分出現(xiàn)損傷或遺傳缺陷都將會導致腎小球過濾屏障功能障礙壕吹，從而使得尿液中蛋白質(zhì)含量升高引發(fā)腎臟疾病。

01研究介紹

Suleiman等人通過結(jié)合來自亞衍射分辨率隨機光學重建顯微鏡（STORM）和電子顯微鏡（EM）的數(shù)據(jù)辉哥，表明小鼠和人的腎小球基底膜中蛋白質(zhì)排列相似桦山，形成了獨特的分層結(jié)構(gòu)，這表明基底膜組織在腎功能中起著關鍵作用醋旦。

同時恒水，該研究揭示了細胞外基質(zhì)蛋白的超微結(jié)構(gòu)，通過對小鼠和人GBM中聚集蛋白俗耗、層粘連蛋白和膠原蛋白IV的N-末端和C-末端附近結(jié)構(gòu)域的單獨分析姑郊，揭示了高度定向的大分子組織。除此之外缝聋，這項工作還提供了一種研究不同類型組織中基底膜結(jié)構(gòu)的方法裂膛，首次實現(xiàn)了對復雜ECM組織的納米級觀測。

02研究結(jié)果

1废徙、用STORM和STORM/Deep-Etch電子顯微鏡對比成像腎小球濾過屏障的超微結(jié)構(gòu)

為了揭示 GBM 內(nèi)的超分子結(jié)構(gòu)紧贪，作者使用與 Alexa 647（一種明亮的熒光光敏染料）結(jié)合的抗體對腎臟切片中的腎小球進行了 STORM 成像。

由于 GBM 內(nèi)致密的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡產(chǎn)生了強烈的熒光背景和光散射瞄隶，對從腎臟切片獲取高分辨率 STORM 數(shù)據(jù)構(gòu)成障礙态素，作者對固定和組織切片方法進行了改進程蠕，并最終確定在 200 納米(nm)厚度下對 Tokuyasu 冷凍包埋和冷凍切片最佳第讯。

為了研究集聚蛋白（GBM的主要HSPG成分）在GBM中的組織，作者首先用抗集聚蛋白 C 的抗體標記腎切片辣铡，與傳統(tǒng)的 agrin 免疫熒光圖像相比褒碌，STORM 在 GBM 中解析了兩個不同的 agrinC 層（圖1-A别肄，圖1-B）。

圖1交惯、鼠GBM的STORM和STORM-EM圖像相關性

為了定量記錄 agrinC（集聚蛋白的 C 端 ）的分布次泽，作者數(shù)字化選擇了腎小球的多個區(qū)域。通過抗 agrinC 和唾液蛋白 podocalyxin 的抗體進行雙重標記席爽，對 GBM 與側(cè)翼足細胞和內(nèi)皮細胞之間的關系進行成像意荤，后者在內(nèi)皮細胞和足細胞表面都有表達。雙通道 STORM 成像顯示只锻，兩層 agrinC 確實位于兩層 podocalyxin 之間（圖1-E玖像、圖1-F和圖1-圖補充 1）。

圖1-圖補充1齐饮、EM/STORM相關的低放大倍率圖像

為了進一步關聯(lián) STORM 分子定位捐寥，作者開發(fā)了一種混合 STORM-電子顯微鏡 (EM) 方法（參見圖1-圖補充2中的示意圖），同樣也證實了 GFB 的超微結(jié)構(gòu)特征祖驱。

圖1-圖補充2握恳、示意圖顯示處理樣品的步驟

2、在 GBM 內(nèi)定位分子

在建立了樣本制備捺僻、STORM 成像和 EM 相關性的方法后乡洼，通過比較各種 ECM 組件的位置來分析 GBM 的分子組織。利用 agrinC 的穩(wěn)健和雙峰分布嚼讹，作者使用了一種定位方案甩澳，其中兩個 agrinC 層之間的中心位置被設置為原點，第二個蛋白質(zhì)的位置艰耿，與 agrinC 一起通過雙色 STORM 成像岗师，通過在多個區(qū)域和腎小球上重復該過程，可以高精度地確定 GBM 中各種蛋白質(zhì)表位的位置苔盆。本研究中繪制的各種 ECM 蛋白及其表位如圖2-圖補充1所示瘩邀。

圖2、在GBM內(nèi)定位分子結(jié)構(gòu)域

圖 2-圖補充1茵窃、抗原表位與Agrin依矿、Laminin和Collagen IV結(jié)構(gòu)之間的關系

3、腎小球基底膜成分在Alport綜合征小鼠模型中的分布

腎小球基底膜（GBM）成分的獨特分布促使作者評估 GBM 的組織是否在基底膜的特定疾病中受到破壞漏北。因此范蛉，作者分析了常染色體隱性遺傳 Alport 綜合征的小鼠模型，該模型由于 COL4A3 無效突變而缺乏膠原α3α4α5（IV）網(wǎng)絡舵牛。

在人類和小鼠中份噪，該網(wǎng)絡的缺乏會導致膠原 α1α1α2（IV）表達的代償性增加，通常會在成人 GBM 中以低水平被發(fā)現(xiàn)援制。盡管有這種代償作用戏挡，GBM 仍會出現(xiàn)節(jié)段性分裂和增厚芍瑞，這與血尿、蛋白尿和進行性腎功能衰竭有關褐墅。

為了研究該疾病模型中 GBM 的結(jié)構(gòu)拆檬，作者檢測了 agrinC 和膠原α1α1α2（IV）的組織，最終得出結(jié)論妥凳，完整的膠原 α3α4α5（IV）網(wǎng)絡有助于維持健康 GBM 中聚集蛋白和膠原 α1α1α2（IV）的組織竟贯。（圖3）

圖3、Alport綜合征小鼠模型中GBM分子結(jié)構(gòu)的分解

03研究總結(jié)

確定細胞外基質(zhì)蛋白（ECM）的結(jié)構(gòu)逝钥、分子相互作用以及空間組織是理解其在組織功能澄耍、形態(tài)發(fā)生和疾病中發(fā)揮作用的重要步驟。該研究描述了一種新的超分辨率熒光顯微鏡方法來重建 GBM 內(nèi) ECM 蛋白的分子結(jié)構(gòu)晌缘，并且通過使用 STORM 和 EM 對同一樣品進行超微結(jié)構(gòu)成像齐莲，實現(xiàn)了在致密組織切片中觀測系統(tǒng)的納米級分子映射。這種方法的穩(wěn)健和相對快速的吞吐量使我們能夠重建小鼠和人類惡性膠質(zhì)瘤（GBMs）的分子結(jié)構(gòu)磷箕。

圖4鳖直、力顯智能自主研發(fā)的超高分辨率顯微成像系統(tǒng)iSTORM

寧波力顯智能科技有限公司(INVIEW)現(xiàn)已發(fā)布的超高分辨率顯微成像系統(tǒng) iSTORM，采用了源自諾貝爾化學獎原理的 STORM 超高分辨率顯微成像技術, 實現(xiàn)了光學顯微鏡對衍射極限的突破侍肯，使得在 20 nm的分辨率尺度上從事生物大分子的單分子定位與計數(shù)姥咖、亞細胞及超分子結(jié)構(gòu)解析、生物大分子生物動力學等的研究成為現(xiàn)實身犯，從而給生命科學碟灾、醫(yī)學等領域帶來重要突破 。

超高分辨率顯微成像系統(tǒng) iSTORM 具有 20 nm超高分辨率动娄、3通道同時成像倾秤、3D同步拍攝、實時重構(gòu)篓疚、2小時新手掌握等特點衬朗，已實現(xiàn)活細胞單分子定位與計數(shù)，并提供熒光染料選擇掂演、樣本制備捧贺、成像服務與實驗方案整體解決方案， 以納米級觀測精度栓拜、高穩(wěn)定性座泳、廣泛環(huán)境適用、快速成像幕与、簡易操作等優(yōu)異特 性挑势，獲得了超過50家科研小組和100多位科研人員的高度認可。

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參考文獻：

Hani Suleiman, Lei Zhang, Robyn Roth, John E Heuser, Jeffrey H Miner, Andrey S Shaw, Adish Dani (2013) Nanoscale protein architecture of the kidney glomerular basement membrane eLife 2:e01149

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