跨膜蛋白裝配γ-分泌酶是約100種1型跨膜蛋白的受調(diào)控膜內(nèi)加工（RIP）中的關(guān)鍵蛋白酶。 重要的是，它在 阿爾茨海默病 （AD）中具有病理作用岁之，因?yàn)樗鼜牡矸蹣忧绑w蛋白（APP）生成神經(jīng)毒性淀粉樣β肽。因此岸浑，從生物學(xué)和治療學(xué)的角度來(lái)看， γ-分泌酶的定位研究 都是至關(guān)重要的珊场。

盡管在許多實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行了幾年的努力蔫狰，目前尚不清楚γ-分泌酶在神經(jīng)元中的何處發(fā)揮其活性。其中技術(shù)挑戰(zhàn)之一是歪缅，活性酶含有四種蛋白質(zhì)組分计鹦，并且大多數(shù)亞細(xì)胞區(qū)室不能通過(guò)傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡進(jìn)行空間分辨。

研究介紹(節(jié)選)

γ-分泌酶是阿爾茨海默病（AD）病理學(xué)中的關(guān)鍵角色就壳，因?yàn)樗呋矸蹣忧绑w蛋白（APP）加工的最后一步搭为，導(dǎo)致神經(jīng)毒性淀粉樣β-肽（Aβ）的形成缺西，Aβ是AD患者大腦中淀粉樣斑塊的主要成分涤伐。γ-分泌酶產(chǎn)生長(zhǎng)度可變的Aβ，尤其是42和43個(gè)氨基酸的變體（Aβ42和Aβ43）易于形成神經(jīng)毒性寡聚體缨称。AD患者海馬神經(jīng)元中Aβ42的細(xì)胞內(nèi)水平升高凝果，在突觸中蓄積，并與AD病理學(xué)相關(guān)睦尽。直接抑制γ-分泌酶作為AD的治療策略是復(fù)雜的器净，因?yàn)槌鼳PP外，該酶還有大約100種不同的底物当凡，包括Notch山害。重要的是，已證明Aβ是在突觸處產(chǎn)生的沿量，這是在突觸前還是突觸后發(fā)生的還存在爭(zhēng)議浪慌。這種不確定性部分是由于確定突觸亞結(jié)構(gòu)所涉及的技術(shù)挑戰(zhàn)。

在這里朴则，作者使用了兩種納米技術(shù) STORM 和 STED 顯微鏡的強(qiáng)大組合來(lái)可視化γ-分泌酶在神經(jīng)元中的位置权纤。作者發(fā)現(xiàn)γ-分泌酶存在于 突觸前 和 突觸后區(qū)室 。研究中乌妒，作者進(jìn)一步表明該酶在 突觸后膜中 非常接近突觸間隙處富集眉挥，以及NMDA受體表明γ-分泌酶存在于突觸后質(zhì)膜。研究中日频，作者以高精度的數(shù)據(jù)顯示了 突觸的三維位置 深七，并解決了長(zhǎng)期以來(lái)關(guān)于γ-分泌酶突觸位置的爭(zhēng)論。

研究結(jié)果(節(jié)選)

共聚焦顯微鏡顯示浮块，樹(shù)突形成了幾個(gè)突觸粉霹，軸突與樹(shù)突平行或在樹(shù)突之間延伸（圖1a），在軸突和樹(shù)突中都發(fā)現(xiàn)了γ-分泌酶砂彻，并在突觸中富集（圖1a）陷今。PS1和nicastrin的染色顯示港排，這些成分與GTB在相同的區(qū)域，也在其他區(qū)域發(fā)現(xiàn)（圖1b和c）吻毅。在單獨(dú)生長(zhǎng)的軸突中筑背，即在很大程度上與樹(shù)突分離的軸突中，γ-分泌酶富集在前扣突結(jié)構(gòu)中（圖1d）妆墩。這種酶也在軸突末端突觸中富集（圖1d）寸靶。γ-分泌酶的STED圖像，與作為軸突標(biāo)記物的Tau蛋白共同標(biāo)記践付，進(jìn)一步證實(shí)γ-分泌酶在前結(jié)中富集秦士，并且顯示γ-分泌酶染色在前結(jié)的外部最強(qiáng)（圖1e）。通過(guò)STORM圖像進(jìn)一步證實(shí)了γ-分泌酶在棘上的富集永高，其中γ-分泌酶被GTB和Alexa 647標(biāo)記的鏈霉親和素染色（圖1f）隧土。因此，三種不同的顯微鏡技術(shù)顯示γ-分泌酶在神經(jīng)元突觸處富集命爬。

圖1 通過(guò) dSTORM等 分析小鼠原代海馬神經(jīng)元軸突曹傀、樹(shù)突和棘中γ-分泌酶的定位。

(a)MAP 2染色（藍(lán)色）饲宛、tau（綠色）和γ-分泌酶（紅色）染色的周圍軸突的放大樹(shù)突的共焦圖像皆愉。如圖所示，在上部面板中顯示各個(gè)污漬艇抠，而在下部面板中顯示合并圖像的不同組合幕庐。(b)樹(shù)突特寫(xiě)中PS1和γ-分泌酶標(biāo)記的共聚焦圖像。箭頭指向PS1和γ-分泌酶共染色的突觸區(qū)域（黃色）家淤。(c)樹(shù)突特寫(xiě)中PS1和nicastrin標(biāo)記的共聚焦圖像异剥。箭頭指向突觸區(qū)，同時(shí)染色的是nicastrin和γ-分泌酶（黃色）颖倾。(d)共焦圖像相同的細(xì)胞的軸突與τ(a)染色在綠色上面板,γ-secretase紅色中間面板和合并后的圖像在底部面板匀铸。合并后的形象的插圖顯示了一個(gè)放大部分的MAP2(藍(lán)色)。(e)結(jié)合共聚焦顯微鏡和STED顯微鏡（γ-分泌酶才褂，中圖）觀察軸突結(jié)中活性γ-分泌酶的富集讥认。底部面板中顯示合并圖像。(f)活性γ-分泌酶（紅色）的dSTORM圖像與明場(chǎng)圖像重疊详贿。注意棘上活性γ-分泌酶的富集活益。

γ-分泌酶在突觸處的富集使我們研究該酶是否存在于突觸前或突觸后區(qū)室中，這些區(qū)室由僅20-25nm寬的裂隙隔開(kāi)权惊。這個(gè)距離比傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡獲得的分辨率小10倍左右漫窑，因此STORM被用于更好地顯示突觸位置。由于我們用STORM進(jìn)行成像抹播，因此我們可以從不同角度研究突觸素和γ-分泌酶的分布（圖2a）榴栏。γ-分泌酶和突觸囊泡蛋白之間的接近度從各個(gè)角度都很明顯像鹤，在某些情況下，突觸囊泡蛋白和γ-分泌酶信號(hào)之間的距離小于10nm泌绩。

圖2 突觸中γ-分泌酶的STORM成像

(a)活性γ-分泌酶在突觸前區(qū)的定位顯示γ-分泌酶（紅色）和突觸前標(biāo)記突觸囊泡蛋白（藍(lán)色）哩簿。左上方的面板顯示了典型的STORM圖像，左側(cè)為明場(chǎng)疊加酝静，中間和右側(cè)面板放大节榜，右側(cè)顯示了單個(gè)突觸區(qū)域。下圖從三個(gè)不同角度顯示了在3D視圖中顯示的相同突觸别智，其中紅色宗苍、綠色和藍(lán)色線分別表示X、Y和Z方向薄榛。(b)活性γ-分泌酶在突觸后區(qū)的定位讳窟，顯示γ-分泌酶（紅色）和突觸后標(biāo)記物PSD 95（藍(lán)色）。左上方的面板顯示了典型的STORM圖像蛇数，位于左側(cè)的明場(chǎng)覆蓋圖上挪钓，中間和右側(cè)面板的放大倍數(shù)增加。下面板從三個(gè)不同角度顯示了3D視圖中顯示的同一突觸耳舅，其中符號(hào)中的紅色、綠色和藍(lán)色線分別表示X倚评、Y和Z方向浦徊。

突觸后密度和突觸間隙之間的距離表明γ-分泌酶在突觸后質(zhì)膜中富集（圖5a-e）。STORM分析顯示NMDAR2B和γ-分泌酶之間非常接近洲猿，這為突觸后膜中存在γ-分泌酶提供了進(jìn)一步的證據(jù)（圖3）获隆。

圖3 γ-分泌酶在突觸后質(zhì)膜的定位

(a)STED圖像顯示γ-分泌酶（紅色）非常靠近樹(shù)突棘中的突觸間隙（白色箭頭）村会。突觸素（藍(lán)色）和PSD95（綠色）分別標(biāo)記突觸前和突觸后側(cè)涌遏。(b)γ-分泌酶（紅色）和NMDAR 2B（綠色）的STORM成像。(c)與（b）中的右圖相同的突觸后膜區(qū)域從三個(gè)不同角度顯示在3D視圖中泌拐，其中紅色基差、綠色和藍(lán)色線分別表示X、Y和Z方向威球。

通過(guò)以上研究結(jié)果宅蜒，作者發(fā)現(xiàn)γ-分泌酶主要存在于突觸前區(qū)室的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器中，而在突觸后區(qū)室的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器和質(zhì)膜中都有發(fā)現(xiàn)蜓浦。突觸前和突觸后區(qū)室中的豐度隨著突觸的成熟而增加捍农。作者的研究結(jié)果表明，Aβ可以在突觸前和突觸后區(qū)室產(chǎn)生绳拧。因此壹店，本研究對(duì)于進(jìn)一步了解AD病理學(xué)具有重要意義猜丹，這與未來(lái)創(chuàng)建開(kāi)發(fā)AD治療的新方法密切相關(guān)。

iSTORM預(yù)約試拍

目前在國(guó)內(nèi)硅卢，隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡STORM已成功實(shí)現(xiàn)商用居触，有需要STORM成像技術(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究的專家老師們，請(qǐng)文末填寫(xiě)問(wèn)卷老赤，即可預(yù)約獲得 iSTORM 超高分辨率顯微成像系統(tǒng)試拍服務(wù)~

力顯智能現(xiàn)已發(fā)布的超高分辨率顯微成像系統(tǒng) iSTORM轮洋，成功實(shí)現(xiàn)了光學(xué)顯微鏡對(duì)衍射極限的突破，使得在20納米的分辨率尺度上從事生物大分子的單分子定位與計(jì)數(shù)抬旺、亞細(xì)胞及大分子復(fù)合物結(jié)構(gòu)解析弊予、生物大分子生物動(dòng)力學(xué)等的研究成為現(xiàn)實(shí)，從而給生命科學(xué)开财、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域帶來(lái)重大突破 汉柒。

雙12特惠??iSTORM免費(fèi)試拍：每個(gè)課題組都有1次免費(fèi)試拍機(jī)會(huì)，需要用戶提供樣本和一抗责鳍，需提前溝通碾褂。

超高分辨率顯微成像系統(tǒng)iSTORM具有20nm超高分辨率、 3D成像历葛、多通道同時(shí)成像光路設(shè)計(jì)达迁、實(shí)時(shí)重構(gòu)、2小時(shí)新手掌握等特點(diǎn)宾哼，已實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞單分子定位與計(jì)數(shù)仔约，并提供熒光染料選擇、樣本制備压荠、成像服務(wù)與實(shí)驗(yàn)方案整體解決方案淫韧，以納米級(jí)觀測(cè)精度、高穩(wěn)定性韩宦、廣泛環(huán)境適用嘿帆、快速成像、簡(jiǎn)易操作等優(yōu)異特性计胶，獲得了超過(guò)50家科研小組和100多位科研人員的高度認(rèn)可泞氯。

參考文獻(xiàn)

References

[1] G. Mitchell, R. R. Isberg, Cell Host Microbe 2017, 22,166–175.

[2] S. Pandey, T. Kawai, S. Akira, Cold Spring Harbor Perspect. Biol. 2015, 7,a016246.

[3] a) M. S. Siegrist, S. Whiteside, J. C. Jewett, A. Aditham,F.Cava, C. R. Ber-tozzi, ACS Chem. Biol. 2013, 8,500–505;b)P.Shieh,M.S.Siegrist, A. J.Cullen, C. R. Bertozzi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2014, 111,5456–5461;c) G. W. Liechti, E. Kuru, E. Hall, A. Kalinda,Y.V.Brun, M. VanNieuwenhze,A. T. Maurelli, Nature 2014, 506,507–510.

[4] a) B. M. Swarts, C. M. Holsclaw, J. C. Jewett, M. Alber,D.M.Fox, M. S.Siegrist, J. A. Leary,R.Kalscheuer,C.R.Bertozzi,J.Am.Chem.Soc.2012,134,16123–16126; b) K. M.Backus,H.I.Boshoff, C. S. Barry,O.Boutur-eira, M. K. Patel, F. D’Hooge, S. S. Lee, L. E. Via, K. Tahlan, C. E. Barry,B.G.Davis, Nat. Chem.Biol. 2011, 7,228–235;c)F.P.Rodriguez-Rivera, X.Zhou, J. A. Theriot, C. R. Bertozzi, J. Am. Chem. Soc. 2017, 139,3488–3495.

[5] D. C. Dieterich, A. J. Link, J. Graumann, D. A. Tirrell, E. M. Schuman, Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 2006, 103,9482–9487.

[6] A.Mahdavi,J.Szychowski,S.Hess, O. Schneewind,S.K.Mazmanian, D. A. Tirrell, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 2014, 111,433–438.

[7] a) M. Grammel, P. D. Dossa, E. Taylor-Salmon,H.C.Hang, Chem.Commun. 2012, 48,1473–1474;b)M.Grammel, M. M. Zhang, H. C.Hang, Angew.Chem. Int. Ed. 2010, 49,5970–5974; Angew.Chem. 2010,122,6106–6110; c) S. Lin, Z. Zhang, H. Xu, L. Li, S. Chen, J. Li, Z. Hao,P. R. Chen, J. Am. Chem. Soc. 2011, 133,20581–20587.

[8] J. T. Ngo, J. A. Champion, A. Mahdavi, I. C. Tanrikulu, K. E. Beatty, R. E.Connor,T.H.Yoo, D. C.Dieterich, E. M. Schuman, D. A. Tirrell, Nat. Chem.Biol. 2009, 5,715–717.

[9] A. G. Chande, Z. Siddiqui,M.K.Midha, V. Sirohi, S. Ravichandran, K. V. S.Rao, Sci. Rep. 2015, 5,13430.

[10] R. Hatzenpichler,S.A.Connon, D. Goudeau, R. R. Malmstrom,T.Woyke,V. J. Orphan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2016, 113,E4069–E4078.